A. Tujuan
Mengetahui bakteri gram positif dan bakteri gram negatif
B. Dasar Teori
Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :
1. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan
sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan.
Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk
mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan
pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik
(suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan
sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat
mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa
digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet,
dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi
menjadi dua jenis pewarnaan.
a. pewarnaan asam
Merupakan
pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya
untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan
positif adalah metilen biru dan air furksin.
b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan
basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri
tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan
ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini
berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini
menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.
2. Pewarnaan Diferensial (Gram)
Pewarnaan
Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram
negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode
ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian
Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri
Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan
mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,
sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu
pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang
membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah
muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri
ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
a. Bakteri Gram Negatif
Bakteri
gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan
mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara
bakteri gram negative tidak.
b. Bakteri Gram Positif
Bakteri
gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu
sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau
ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna
merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini
terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri
(Aditya,2010)
Bakteri
gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada
saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif
memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah
pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat
dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru
(Fitria, 2009).
Sel
bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi
terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu
dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).
Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.
Sifat
|
Bakteri garam (+)
|
Bakteri gram negatif(-)
|
Komposisi dinding sel
|
Kandungan lipid rendah (1-4%)
|
Kandungan lipid tinggi
|
Ketahanan terhadap penisilin
|
Lebih sensitif
|
Lebih tahan
|
Penghambatan oleh pewarna basa (VK)
|
Lebih dihambat
|
Kurang dihambat
|
Kebutuhan nutrisi
|
Kebanyakan spesies relatif kompleks
|
Relatif sederhana
|
Ketahanaa terhadap
perlakuan fisik
|
Lebih tahan
|
Kurang tahan
|
(Manurung, 2010).
Pewarnaan
tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh – Neelson dengan
pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan
metilen blue Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan
penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk mengurangi tegangan
permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang mengandung
pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).
Sekali
sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri
menahan zat warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan
sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3%
HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat
intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak
digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini,
organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan
tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau
lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah
dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam.
Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna
tandingan biru metilen oleh sel, sehingga bakteri tersebut tampak biru
(Hadioetomo, 1993).
Pewarnaan
Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh
permukaan sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar
asap tetapi tidak sampai mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan
kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna
dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu
larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan
dan dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3
menit, kelebihan larutan dibuang. Larutan methylene blue 0,1% dituang
sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang
dan dicuci dengan air mengalir (Karuniawati, 2005).
4. Pewarnaan Khusus
Pewarnaan
khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau
tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh
pewarnaan khusus :Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum, dan Bacillus adalah
bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora
merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya
bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia
seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia. Tujuan
dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel
vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat
dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai
bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan
sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (Aditya, 2010)
a. Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal
violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan
menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan
air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada
latar belakang yang berwana biru gelap.
b. Pewarnaan spora
Dinding spora relatif tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara memanaskan preparat.
c. Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
d. Pewarnaan nucleoid
Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA (Rudi, 2010).
A. Alat dan Bahan
NO
|
Alat
|
Jumlah
|
Bahan
|
1
|
Jarum ose
|
1
|
Biakan murni B. cereus dan E.colipada medium NA yang berumur 24 jam
|
2
|
Pembakar spirtus
|
1
|
Aquades steril
|
3
|
Kaca preparat
|
1
|
Larutan hucker’s crystal violet
|
4
|
Pipet tetes
|
1
|
Larutan mordan lugol iodine
|
5
|
Mikroskop
|
1
|
Larutan alkohol 96%
|
6
|
Gelas kimia
|
3
|
Larutan safranin
|
7
|
Kaca objek
|
1
| |
8
|
Tabung reaksi
|
1
|
B.
Kaca Objek
|
Dibersihkan dengan menggunakan alkohol
Dikeringkan dengan cara dianging-anginkan pada api
Kaca objek yang telah steril
|
Jarum ose
|
Dibakar sampai merah
Dicelupkan pada alkohol
Jarum ose yang steril
|
Sampel e.coli dan Bacillus
|
Diambil menggunakan jarum ose (medianya jangan sampai terambil).
Disimpan di atas kaca objek
Aduk pelan-pelan sampai tercampur dengan aquades yang telah ada pada kaca objek
Kaca objek yang telah berisi sampel
|
Ditetesi violet sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)
Dicuci dengan air yang mengalir
Ditetesi lugol sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)
Dicuci dengan air yang mengalir
Ditetesi alkohol 96% ( diamkan selama 45 detik)
Dicuci dengan air yang mengalir
Ditetesi safranin sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)
Dicuci dengan air yang mengalir
Dikeringkan pada udara terbuka
Hasil
|
A. Hasil Pengamatan dan Pembahasan
Tabel pengamatan
Gambar 1. Fiksasi
Sumber : dokumentasi Pribadi
|
Bakteri
yang telah di ambil kemudian di simpan pada kaca objek yang dicampur
dengan setetes aquades. Setelah itu difiksasi di atas api sampai kering.
Pemanasan tidak boleh terlalu panas karena bisa merusak sel bakteri.
|
Gambar 2. Pada saat ditetesi violet
Sumber : dokumentasi pribadi
|
Setelah
difiksasi, sampel ditetesi violet. Sampai bakteri terendam. Lalu
biarkan selama 1 menit. Setelah itu, cuci di air yang mengalir. Hasilnya
terdapat warna ungu pada kaca objek.
|
Gambar 3. Penambahan lugol
Sumber : dokumentasi pribadi
|
Kemudian
bakteri ditetesi lugol sampai terendam lalu biarkan 1 menit dan cuci di
air yang mengalir. Setelah dicuci, kaca objek tetap berwarna ungu
akibat dari tetesan violet.
|
Gambar 4. Saat ditetesi alkohol 96%
Sumber : dokumentasi pribadi
|
Setelah
ditetesi lugol dan dicuci, bakteri ditetesi alkohol 96% dan dibiarkan
selama 45 detik. Setelah itu, cuci di air yang mengalir. Setelah dicuci,
warna ungu pada kaca objek menghilang akibat penambahan dari alkohol.
|
Gambar 5. Pada saat ditetesi safranin
Sumber : dokumentasi pribadi
|
Setelah
warna ungu pada bakteri hilang, kemudian bakteri ditetesi safranin
sampai terendam dan biarkan selama 1 menit. Kemudian cuci di air yang
mengalir. Hasilnya, bakteri yang dihasilkan berwarna merah muda.
Gambar 6. Hasil pewarnaan
Sumber : dokumentasi pribadi
|
Gambar 7. Hasil pengamatan pada mikroskop (pembesaran 40x10)
Sumber : dokumentasi pribadi
Gambar B. cereus pada pembesaran 16x10
Sumber : Purna,2012.laporan praktikum mikrobiologi
Pewarnaan
Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan
penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada
tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak
sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri
berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan
gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan
membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel
tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Manurung, 2010).
Penambahan violet pada bakteri. Kristal
violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini
merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada
mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu
berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan
seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna
(ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan
meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme
pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan
komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein
dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan
dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.
Penambahan lugol pada bakteri. Lugol merupakan
pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer
yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama.
Pemberian lugol pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap
antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif,
sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram
negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Lugol yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat.
Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas objek glass tersebut kemudian didiamkan selama 45 detik. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga
warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang berfungsi
untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel
bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada
komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna,
maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak
kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol
pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu
mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi
tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi
lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.
Selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas kaca objek tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga
warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna
sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah
kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata
lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta
menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke
dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram
negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi
dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel
dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk
sehingga sel berwarna ungu.
Pemberian
reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain
dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna
tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu
singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke
yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung
cepat.
Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap kaca objekdengan menggunakan air.
pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna
yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing
reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan dari air dengan
menggunakan kertas tissu agar aquades tidak tercampur dengan reagen
atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir,
gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk
warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika
terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri
gram negatif.
B. Kesimpulan
Dari
praktikum ini dapat disimpulkan bahwa, bakteri e.coli yang berwarna
merah merupakan gram negatif dan bacillus yang berwarna ungu merupakan
gram positif.
Daftar Pustaka
Aditya,Mushoffa.2010.Teknik Pewarnaan Bakteri.
Fitria, Bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram Negatif).http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-positif-dan-gram-negatif. 11 November 2010.
Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Gramedia.
Karuniawati,
Risdiyani, S. Nilawati, Prawoto, Y. Rosana, B. Alisyahbana, I. Parwati,
Wia Melia, dan T.M. Sudiro. 2005. Perbandingan Tan Thiam Hok, Ziehl
Neelsen dan Fluorokrom sebagai Metode Pewarna Basil Tahan Asam untuk
Pemeriksaan Mikroskopik Sputum. Makara Kesehatan Vol. 9 No. 1.
Manurung, Pebrin.2010.Pengamatan Bentuk Bakteri.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar